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菌群移植已广泛应用于消化系统疾病和肠道菌群紊乱所致的消化系统外疾病的治疗，然而菌群移植调节肠道微生物群以及改善疾病的作用机制仍待进一步揭示。承葛生物此次发表的活菌分析方法，既可研究活菌组成，也可用于详细分析菌群移植活菌的类型和数量，对于理解UC的发病机制以及菌群移植治疗UC的作用机制至关重要，也为微生态领域提供了研究活菌数量与组成的创新研究方法与策略。

Shifts and importance of viable bacteria in treatment of DSS-induced ulcerative colitis mice with FMT

FMT治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠期间活的细菌群落的改变及其重要性

溃疡性结肠炎（UC）已成为全球公共卫生问题，迫切需要新的治疗方法。如今，肠道菌群移植（FMT）在治疗UC的临床试验与应用中取得了显著的成功，但它如何调节肠道微生物群以及改善疾病的机理急需进一步阐述与揭示。

随着高通量技术的发展，宏基因组学（metagenomics）已经成为研究微生物群落物种及功能的前沿科学，在肠道微生物、环境微生物等研究领域具有广泛应用。在目前主流分析中，宏基因组学主要通过对微生物群落全部DNA进行高通量测序，然而，这种分析方法往往忽略了活菌DNA的变化。此外，随着研究的深入，在FMT中，活的微生物群被认为发挥着主要的治疗作用，因为这些微生物群能够在受者肠道中的定植，从而导致受者肠道发生变化，达到治疗的效果。因此，关注活的菌群对了解FMT的作用机制，探索关键的肠道菌群具有重要意义。

在本项研究中，我们开发了一项创新方法来评估UC小鼠模型以及FMT治疗前后小鼠粪便中活的细菌群落结构的改变及其重要性。首先，基于小鼠的组织病理学和症状分析了FMT治疗效果。同时，结合PMA处理与16S rRNA基因测序，分别分析FMT前和后活菌结构变化，以及DSS和对照组之间活菌的差异。总之，该方法可准确评价肠道微生物群中活菌的变化，更有效的帮助我们分析活菌数以及活菌组成，为微生态领域提供了研究活菌数量与组成的创新研究方法与策略。

研究结果
·高低活性菌群移植对DSS诱导的结肠炎小鼠疗效观察

为了研究FMT中活菌对结肠炎的缓解作用。我们通过给30只小鼠水中添加3%DSS，自由饮水连续5天，诱导溃疡性结肠炎小鼠模型。然后在第6天开始对小鼠进行FMT干预，连续3天(图1A)。对照组（CON）的小鼠（n=10）精神状态良好，没有腹泻和软便。DSS小鼠从造模第3天开始出现稀便，随后出现严重的软便、血便。DSS诱导的小鼠被平均分为三组，分别进行FMT的高活性粪便、灭活粪便和生理盐水治疗。从图1B中，我们可以看到前4天HF组（高活性粪便组）、IF组（灭活粪便组）和NF组（生理盐水组）之间没有明显的差异，所有小鼠体重均呈下降趋势。IF结肠长度与CON组相比，结肠长度明显减少，而HF组、IF组和NF组之间没有明显的差异（图1C）。DSS诱导的小鼠的DAI评分在第3天增加，其中HF组的小鼠在第3天的DAI评分明显高于CON组，HF组的小鼠的DAI评分明显低于NF组（图1D）。在组织学评分方面，HF组的评分明显低于IF和NF组，而IF组和NF组之间没有显著差异（图1E）。同时，组织学分析进一步揭示了观察到的结肠标本的组织病理学状况如图1F所示，CON组和HF组的结肠组织形态正常，组织结构层次分明，粘膜层、粘膜下层和肌肉层清晰可见，隐窝和杯状细胞良好，排列整齐。而IF组和NF组看到不同数量的炎症细胞，溃疡病灶附近的隐窝扩张。总之，这些结果表明，FMT中的活菌能够参与并改善临床上的结肠炎症状况和结肠损伤，而死菌则不能。

·DSS小鼠与正常小鼠之间的组织学和活的细菌群落差异

组织学分析显示，与正常小鼠相比，DSS诱导的小鼠在结肠粘膜层形成溃疡病灶，坏死扩散到整个粘膜，导致固有层脱落和结缔组织增生，其间有不同数量的炎症细胞浸润，溃疡病灶附近的隐窝扩张（图3A）。另一方面，与CON组相比，UC小鼠粪便活细菌的α多样性指数Observe、Shannon和J明显下降（P<0.05，图3C）。通过PCoA图清楚地观察到结肠炎小鼠和正常小鼠之间的活的细菌群落的聚类有显著差异（P<0.05，图3B）。此外，DSS诱导的结肠炎小鼠的活细菌组成在属的水平上与对照组存在明显不同。与CON组相比，包括Massilia、Rikenella、Butyricoccus和Enterococcus在内的16个属中减少，而包括Akkermansia、Blautia和Odoribacter在内的19个属在DSS组显著增加（P<0.05，图3D）。这些结果表明，DSS诱导后显著改变了小鼠的肠道中活的细菌群落和结肠黏膜结构。

通过16S rRNA基因高通量测序分析了HF、NF和IF组的肠道微生物群的变化。HF组的丰富度指数显著低于IF和NF组，但Shannon和J指数没有明显差异（图4A）；PCoA图分析显示，治疗后三组的活的细菌群落结构存在着显著差异（P<0.05，图4B）。利用SPEC-OCCU对HF、IF和NF组的微生物群进行特异性和占有率（≥0.7）分析（图4C），共鉴定到与HF组密切相关的五个特定的属，即Bacteroides、Lactobacillus、Halomonas、Bifidobacterium和Fusobacterium。Fusobacterium的相对丰度在IF组显著高于NF组（P<0.05），而HF组与其他两组没有明显差异。然而，HF组的Halomonas和Lactobacillus的相对丰度明显高于IF组（图4D）。在FMT前和后对比分析中，也观察到Bacteroides、Lactobacillus、Halomonas、Bifidobacterium和Fusobacterium的相类似的变化趋势。本次研究鉴定出多个发生显著改变的活细菌属，他们对UC的症状的改善可能起着核心作用，这可能对UC的诊断和治疗具有潜在的意义，值得进一步深入探索。

菌群移植的临床试验正在全球范围内快速推进，其临床适应症也在不断拓展与扩大，临床价值与市场空间巨大、前景广阔。本研究开创性的结合PMA和16s rRNA基因高通测序技术，建立了分析菌群中活菌数量与组成结构的新方法；结合菌群移植实验，证明了高活性菌群在菌群移植中的重要性！通过分析UC小鼠失衡的活菌特征、以及与菌群移植治疗带来的小鼠症状改善密切相关的活菌种类等，为揭示肠道微生物及菌群移植与UC的发生发展和治疗之间的重要关系提供了新视角和新证据。本研究所建立的方法，还可用于菌群移植治疗消化、代谢、肿瘤等各系统疾病的微生态（活菌数量与群落结构）相关研究。